НИТЧАТЫЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ ГЕТЕРОЦИСТНЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ – ОБЪЕКТЫ ГЕНЕТИКИ, ГЕНОМИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ.

2. Сравнительный эколого-физизиологический и геномный анализ новых штаммов-изолятов азотфиксирующих цианобактерий порядка Nostocales, выделенных из природных биоценозов в различных регионах мира.

Руководитель: 

ведущий научный сотрудник, к.б.н. Михеева Лидия Евгеньевна

Творческий коллектив: 

Ведущий научный сотрудник, к.б.н. Карбышева Елена Алексеевна

Научный сотрудник Женавчук Оксана Федоровна

Студент (магистр) Мещерякова Полина Васильевна

Студент (бакалавр) Парадня Евгения Романовна

Начиная с 1977 г. на кафедре генетики Биологического факультета МГУ создавалась коллекция нитчатых азотфиксирующих штаммов Anabaena и Nostoc, в настоящее время насчитывающая 20 штаммов, среди которых есть свободноживущие, ассоциативные и условно-симбиотические изоляты. В коллекции имеются как лабораторные модельные штаммы с полностью секвенированными геномами, так и ранее не изучавшиеся эпифитные штаммы-изоляты с листьев и корней риса во Вьетнаме и группа культивируемых минорных симбионтов различных видов папоротника Azolla, выделенных в ряде лабораторий мира и происходящих из различных, весьма удаленных регионов Земного шара.

Целью данной работы является выделение новых штаммов-изолятов гетероцистных цианобактерий порядка Nostocales из различных географических зон и их комплексное сравнительное изучение,  направленное на оценку биоразнообразия гетероцистных цианобактерий в различных климатических зонах и биотопах и анализ основных адаптационных механизмов у широкой группы представителей этой уникальной группы прокариот.

Рисунок 1. Рост цианобактерий на частицах лиофилизированного (А) или замороженного (Б) грунта из района Оазиса Лансерманна в Антарктиде через месяц инкубации на агаризованной безазотистой среде.

За 2017 год в рамках работы по данному проекту было проведено выделение, субклонирование из смешанных культур и очистка от сопутствующей бактериальной и грибной микрофлоры и получение аксеничных культур новых штаммов гетероцистных цианобактерий порядка Nostocalesиз трех основных изучаемых биотопов: 


1. гиполитная почвоподобная система в районе российской станции «Прогресс» (Восточная Антарктида, Земля Принцессы Елизаветы, Оазис Холмы Ларсеманн в точке с координатами 69° 23' 24'' S, 76° 24' 12'' E); 

2. природные образцы прибрежной воды в нескольких точках Московской и Тверской областей; 

3. природные образцы водных растений Chara vulgaris и почвенных печеночных мхов Marchantia polymorpha в прибрежной зоне реки Раздерихи (Московская область).

Рисунок 2. Микрофотографии филаментов некоторых изолятов цианобактерий порядка. Nostocales из антарктических проб грунта: Tolypotrix sp. (е); Nostoc sp. (а, г, д); Anabaena sp. (б, в).

В результате этих исследований были определены основные морфотипы новых культур из Антарктики, что позволило на первом этапе классифицировать их как представителей родов Nostoc, Anabaena, Trichormus, Tolypothrix, Calothrix согласно современной таксономической классификации порядка Nostocales (Komárek J., Kaštovský J., Mareš J. &. Johansen J. R. (2014). Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera), using a polyphasic approach. Preslia 86: 295–335). В природных образцах из умеренной зоны представителей рода Tolypothrix выделено не было, но были выделены штаммы Nostoc, Anabaena, Trichormus, Calothrix, Gloeotrichia.

Также, одним из стратегических направлений при конструировании эффективных штаммов-продуцентов водорода является отбор новых перспективных штаммов гетероцистных цианобактерий с большой скоростью роста в безазотистой среде и высокой активностью нитрогеназы, обеспечивающей максимальный уровень продукции водорода при отсутствии его рециклизации поглощающей гидрогеназой

На основе анализа инвертированных повторов в геноме Anabaena varibilis ATCC29413 предложены новые праймеры для ПЦР - генотипирования штаммов Anabaena и Nostoc, что позволяет изучать генетическое разнообразие, эволюционные взаимосвязи, а также проводить скрининг природных штаммов, перспективных для фотобиотехнологии.

Модельный штамм A. variabilis является одним из самых эффективных штаммов для получения водород-продуцирующих мутантов. Молекулярно-генетический скрининг штаммов из различных коллекций показал, что среди эпифитных и ассоциативных / симбиотических изолятов Anabaena из различных регионов мира (США, Вьетнам, Израиль) обнаруживаются штаммы, близкие к A. variabilis ATCC29413 по физиологическим и генетическим характеристикам (рис. 3), причем некоторые из них характеризуются повышенным уровнем продукции водорода по сравнению с Anabaena variabilis ATCC29413.

Рисунок 3.

А). Рост штаммов Anabaena на агаризованной среде без связанного азота в миксотрофных условиях(свет + 5мМ фруктозы). 1 Anabaena variabilis ATCC29413, 2 Anabaena sp. 182, 3 Anabaena sp. V5.

Б). Микрофотографии культур исследованных штаммов на среде BG110 (x400). 

Рисунок 4. ПЦР-фингерпринтинг с праймерами к межгенным инвертированным повторам Rep3 и Rep3-1. Матричная ДНК штаммов: 1, 4 –Anabaena variabilis ATCC 29413, 2 – Anabaena sp. 182, 3 – Anabaena sp. V5, 5 – Anabaena azollae (Newton), 6 – Nostoc punctiforme.

Вегетативные клетки всех штаммов имеют цилиндрическую, слегка бочонковидную форму, а гетероцисты – овальную форму. У Newton форма гетероцист как овальная, так и сферическая.


Получены доказательства общности происхождения данных штаммов:

1.Наличие уникальной плазмиды pAvaD.

2.Наличие уникального кластера генов, кодирующих ванадий-зависимую нитрогеназу.

3.Идентичные профили ПЦР-фрагментов, полученные при амплификации геномной ДНК с STRR и REP-праймерами (рис. 4).

Полногеномный анализ штаммов Anabaena sp.182 и Anabaena sp.V5 выявил лишь небольшиегеномные различия с модельным штаммом A. variabilis ATCC29413, связанные, главным образом, с мультипликацией мобильных элементов, что доказывает принадлежность трех штаммов к одному виду цианобактерий.

Генетическая близость геномов этих штаммов позволяет использовать для них методы генетического конструирования, разработанные для Anabaena variabilis ATCC29413, а также проанализировать методами биоинформатикимеханизмы геномных преобразований в процессе дивергенции близкородственных штаммов.

Основные публикации:

1. Михеева Л.Е., Белавина Н.В.. Карбышева Е.А., Шестаков С.В. Молекулярно-генетический анализ новых штаммов Anabaena, выделенных из растительно-цианобактериального сообщества. Микробиология. 2010. Т.79, №5. С.639-646 (L. E. Mikheeva, N. V. Belavina, E. A. Karbysheva, S. V. Shestakov. Molecular genetic analysis of new Anabaena strains isolated from a plant-cyanobacterial community // Microbiology. 2010. V.79, N5. P. 630-637 DOI: 10.1134/S0026261710050073).

2. Михеева Л.Е., Карбышева Е.А., Шестаков С.В. Роль мобильных элементов в эволюции цианобактерий // Экологическая генетика, 2011 г. т.9, №.4. C. 52-62 .( L. E. Mikheeva, E. A. Karbysheva, S. V. Shestakov // Russian Journal of Genetics: Applied Research2013, V. 3, Issue 2, pp 91-101. DOI:10.1134/S2079059713020032 

3. Марданов А.В., Белецкий А.В., Гумерова В.М., Карбышева Е.А., Михеева Л.Е. Новая низкокопийная плазмида цианобактерии Anabaena variabilis // Генетика. 2013. Т.49, №8, с.41-49. (A. V. Mardanov, A. V. Beletskii,  V. M. Gumerov, E. A. Karbysheva, L. E. Mikheeva. New low-copy plasmid in cyanobacteriumAnabaena variabilis // Russian Journal of Genetics. 2013. V.49, №8, с. 798-805. DOI:10.1134/S1022795413080127)

4. Михеева Л.Е.. Карбышева Е.А. Методы генотипирования в филогенетическом анализе цианобактерий // Труды XXI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2013. С.29 – 31.

5. The study of genomic polymorphism in closely related strains of cyanobacteria anabaena variabilis / O. F. Zhenavchuk, A. V. Beletskii, A. V. Mardanov, L. E. Mikheeva // Тезисы Международной научной конференции Физиология и биотехнология оксигенных фототрофных микроорганизмов: взгляд в будущее,. — изд. МГУ Москва, МГУ, 2014. — P. 24–25