НИТЧАТЫЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ ГЕТЕРОЦИСТНЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ – ОБЪЕКТЫ ГЕНЕТИКИ, ГЕНОМИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ.


1.Конструирование и изучение мутантных штаммов цианобактерии Anabaena variabilis ATCC29413, продуцирующих аммоний и молекулярный водород

Руководители:

Ведущий научный сотрудник, к.б.н., Михеева Лидия Евгеньевна,

Профессор, академик РАН, главный научный сотрудник д.б.н. Шестаков Сергей Васильевич

Творческий коллектив:
Ведущий научный сотрудник, к.б.н. Карбышева Елена Алексеевна
Научный сотрудник Женавчук Оксана Федоровна
Студент (магистр) Мещерякова Полина Васильевна

Работа выполняется в сотрудничестве с Центром «Биоинженерия» РАН.


Штамм Anabaena varibilis ATCC29413 более 40 лет интенсивно изучается во многих лабораториях мира с целью расшифровки механизмов азотфиксации, фотосинтеза, метаболизма водорода и дифференцировки (рис. 1). На кафедре генетики работа с этим штаммом, полученным из лаборатории П.Уолка (Мичиган), ведется с 1978 года.


Рис. 1 Клетки азотфиксирующей культуры Anabaena variabilis ATCC29413. (Светящиеся клетки - гетероцисты, специализированные клетки для фиксации азота воздуха).

В нашей лаборатории у штамма Anabaena variabilis ATCC29413 с помощью химического мутагенеза были выделены уникальные мутанты с измененными процессами азотфиксации и метаболизма водорода:

1). Дерепрессированные по нитрогеназе мутанты (устойчивые к аналогу аммония – этилендиамину) способны выделять в среду роста ионы аммония, образующиеся в результате азотфиксации, со скоростью 100 - 150 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час. В наших работах предложено использовать для иммобилизации цианобактерий алюмоборосиликатное волокно (рис. 2), что увеличивает выход аммония в несколько раз - до 300 мк моль NH4+ / мг хлорофилла в час в периодическом реакторе.

Секвенирование гена glnA, кодирующего первый фермент пути ассимиляции аммония у цианобактерий – глутаминсинтетазу, выявило мутации в этом гене у всех этилендиамин-устойчивых мутантов.

2). Штаммы, продуцирующие водород в аэробных и анаэробных условиях в результате снижения активности поглощающей гидрогеназы, которая в клетках дикого типа  рециклизует водород, образующийся в процессе азотфиксации (рис. 3).


Рис. 2. Иммобилизованные на алюмоборосиликатном волокне (справа) дерепрессированные мутанты выделяют в 2-3 раза больше аммония, чем в суспензионной культуре (слева).

Рис. 3. Тест на способность культур выделять водород в микроаэрофильных условиях показывает, что мутанты 17 и 84 выделяют в 3-4 раза больше водорода, чем исходный штамм дикого типа (w.t.). Иммобилизация культур также увеличивает выход водорода.

Совместно с Центром Биоинженерии РАН методом пиросеквенирования проведен полногеномный анализ мутанов РК17 и РК84, и выявлены мутации в генах, контролирующих активность водород-поглощающей гидрогеназы – hupL и hypF, и в ряде других генов, способных влиять на активности нитрогеназы и / или гидрогеназы.

Полученные результаты являются основой для направленного получения эффективных водород-продуцирующих селективно-поддерживаемых мутантных штаммов путем совмещения в одном геноме инсерционных мутаций по генам, влияющим на активность нитрогеназы и поглощающей гидрогеназы (рис. 4).

Рис. 4. Схема экспериментов по генетическому конструированию новых мутантных штаммов Anabaena variabilis с высоким уровне продукции водорода

Гранты по тематике

2012-2013 гг. соисполнители по ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы, тема работы «Изучение генетической природы мутантных штаммов цианобактерий – продуцентов водорода»;

2009 – 2013 гг. – Грант Президента РФ для поддержки Ведущих научных школ

Основные публикации:

1. Mikheeva L.E., Schmitz O., Shestakov S.V., Bothe H. Mutants of the cyanobacterium Anabaena variabilis altered in hydrogenase activity // Z. Naturforsh. 1995. V. 50c. P. 505-510.

2. Шестаков С.В., Михеева Л.Е. Генетический контроль метаболизма водорода у цианобактерий // Генетика. 2006. Т. 42. С. 1512-1525.(S. V. Shestakov, L. E. Mikheeva. Genetic control of hydrogen metabolism in cyanobacteria // Russian Journal of Genetics. 2006, V. 42, Issue 11, pp 1272-1284. DOI:10.1134/S1022795406110093).

3. Михеева Л.Е., Карбышева Е.А., Шестаков С.В. Генетические основы создания штаммов цианобактерий для фотобиотехнологического получения молекулярного водорода // Бюллетень МОИП, отдел. биол. 2007. Т. 112. вып. 1. С. 70-74.

4. Shestakov S.V., Mikheeva L.E., Mardanov A.V., Ravin N.V., Skryabin K.G. Genomic analysis of Anabaena variabilis mutants PK17 and PK84 that are characterised by high production of molecular hydrogen. Advances in Microbiology. 2013. V.3, N4. P. 350-365 DOI: 10.4236/aim.2013.34049

5. New genetic approach to engineering of mutant strains of cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413 with enhanced levels of biohydrogen photoproduction / L. Mikheeva, O. Zhenavchuk, E. Karbysheva, S. Shestakov // FEMS 2015. — Maastricht, the Netherlands, 2015. — P. 1709–1709.